引物（Primer）
- 引物（Primer）是一小段单链 DNA（通常 18~25 个碱基），与模板 DNA 的特定位点互补。包括：Forward Primer（正向引物）和 Reverse Primer（反向引物）。PCR工程中可为 DNA 聚合酶提供“启动点”，定义了 PCR 扩增产物的两端，控制扩增区域的长度和特异性。
| 特性 | 内容 |
|---|---|
| 类型 | 单链 DNA（通常为 18–30 个碱基） |
| 序列来源 | 根据目标基因序列，在软件或数据库中人工设计 |
| 功能 | 提供起始位点，与模板 DNA 上特定区域互补，用于启动 DNA 聚合酶复制 |
| 合成方法 | 固相磷酸三酯法（Phosphoramidite 化学合成） |
pcr引物制造
- PCR 引物（Primer）是实验中用于“起始 DNA 合成”的短链 DNA 分子。制造引物的过程本质上是化学合成寡核苷酸。PCR 引物由专门的核酸合成仪器制造，大致过程如下：
步骤 1：设计引物序列（人工）
你先根据目的基因，在电脑上设计出需要的 5’ → 3’ 的 DNA 序列，比如：
Forward：5’-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA-3’
Reverse：5’-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3’
步骤 2：用“磷酰胺法”合成 DNA
- 从 3’ 端 → 5’ 端一碱基一碱基地拼出来的,每轮合成只加一个碱基，重复进行 N 轮（N = 引物长度）：
| 步骤 | 说明 |
|---|---|
| ① 固相支持物 | 通常用硅珠或树脂，固定第一个碱基的 3’ 端 |
| ② 活化 | 添加下一个磷酰胺单体（例如保护好的 dA、dT、dC、dG） |
| ③ 缩合 | 用催化剂让新碱基接到前一碱基的 5’ 位上形成磷酸二酯键 |
| ④ 氧化 | 将磷三酯氧化成稳定的磷酸结构 |
| ⑤ 脱保护 & 洗脱 | 去除保护基团，从固相物中释放下来，得到引物 |
步骤 3：合成后纯化
- 为了得到高纯度引物，一般以下方法：
| 方法 | 说明 | 应用范围 |
|---|---|---|
| 脱盐 | 最基础，用于普通 PCR、成本低 | 实验室常规用途（如 HIV 检测） |
| PAGE | 聚丙烯酰胺凝胶纯化，高分辨率 | 用于高精度分子克隆 |
| HPLC | 高效液相色谱纯化，杂质少 | qPCR / 探针 / 高保真扩增 |
购买引物
- 从寡核苷酸合成公司定制购买：
在线下单：输入序列、长度、纯化方式、规模（nmol 或 OD），约 1–3 天(和纯化方法有关)的合成周期，样品多以冻干形式寄出，实验室溶解使用（TE buffer 或无酶水）。
| 平台主页 | 平台名称 | 官网链接 | 平台特点 |
|---|---|---|---|
 |
Thermo Fisher（赛默飞世尔） | https://primer.thermofisher.cn/ | Thermo Fisher（赛默飞世尔），这是全球领先的生命科学公司之一，其 DNA 引物相关产品和储存说明在科研中非常权威。 |
 |
金斯瑞（GenScript） | https://www.genscript.com.cn/ | 支持高纯度（PAGE、HPLC） |
 |
上海生工（Sangon Biotech） | https://www.sangon.com/ | 支持常见病毒引物查询，DNA合成引物在线订购操作指南 |
 |
博奥生物（Biosune） | http://www.biosune.com/ | 响应速度快，支持当日出库；适合中等规模实验需求 |
 |
齐碳科技（Tsingke） | https://www.tsingke.com/ | 平台工具界面友好、下单流程清晰；性价比高，适合批量合成 |
 |
丁香通平台 | https://www.biomart.cn/product/s?wd=%E5%BC%95%E7%89%A9 | 聚合信息 |
 |
Bioz 平台 | bioz.com | 聚合信息,PubMed 有引用 |
- GenScript、IDT、Sigma-Aldrich 更多相关链接：
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引物存储
| 形式 | 推荐温度 | 说明 |
|---|---|---|
| 冻干粉 | -20°C（可放冰箱冷冻室） | 室温下短期（几周）没问题，但长期需低温保存 |
| 溶液形式 | -20°C（长期）或 4°C（短期使用） | 避免频繁冻融 |
| 溶剂 | 稳定性 | 说明 |
|---|---|---|
| 无RNA酶无菌水（ddH₂O） | 稳定性中等 | 易受pH波动或杂质影响，不推荐长期存放 |
| TE缓冲液（10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0） | 最佳选择 | Tris缓冲pH，EDTA螯合金属抑制核酸酶，但它可能影响某些酶反应（如酶切） |
溶液状态下的引物更容易降解，分装后存储。一次性配成多个小管（Aliquot），每管仅包含1~2周使用量。工作浓度一般为10 微摩尔/升（10 μmol/L）。高频使用（如qPCR），可把部分溶液分装在 4°C 保存，几周内用完。
避免反复冻融，避免阳光直射，避免长时间室温放置：
| 储存条件 | 推荐保存时限 |
|---|---|
| 冻干粉，-20°C | ≥ 2 年 |
| 溶液，-20°C | 1~2 年 |
| 溶液，4°C | ≤ 1 个月 |
| 溶液，室温 | 几小时以内（仅临时） |