RNA-seq标准化

RNA-seq数据标准化

对基因counts进行校正定量一般有RPKM、FPKM 、TPM和CPM这几种方法。

RPKM(SE)

RPKM (Reads Per Kilobase Million, or Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped)
每千个碱基的转录每百万映射读取的reads

计算RPKM的方法：

1. 计算样本中的总reads，并将该数字除以1,000,000——这是我们的“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor ) 。
2. 将reads数除以“每百万”缩放因子。消除测序深度影响，得到每百万reads（RPM, reads per million ）。
3. 将RPM值除以基因长度（以千碱基为单位），消除基因长度影响，得到RPKM。

FPKM

FPKM (Fragments Per Kilobase Million, or Fragments Per Kilobase of transcript per Million reads mapped) 每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments

FPKM与RPKM非常相似。RPKM是针对单端测序的RNA-seq而言的，其中每个reads对应于一个已测序的单个片段。FPKM用于双端测序的RNA-seq。使用双端测序RNA-seq，两个reads可以对应一个片段（Fragment）。RPKM和FPKM之间的唯一区别是FPKM考虑到两次reads可以映射到一个片段（因此它不会对该片段进行两次计数）。 即 单端测序：reads=fragments，双端测序：2 * reads≈fragments
经过上游处理，双端测序两个reads可以对应一个片段的过程已经完成，最后得到的counts就已经相当于是片段fragments了，因此下游分析由counts计算RPKM、 FPKM这两者的公式完全一致。

TPM

TPM (Transcripts Per Million, or Transcripts Per kilobase of exon model per Million mapped reads)
每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts

计算TPM的方法：

1. 将读数计数除以每个基因的长度（以千碱基为单位），得到每千碱基reads（RPK, reads per kilobase）。(每个样本每个基因counts表达值先除以基因长度。)
2. 计算样本中所有RPK值，然后将其除以1,000,000，得到“每百万”缩放因子 ( “per million”scaling factor )。(计算这个样本中所有基因的RPK，除以10e6。)
3. 将RPK值除以“每百万”缩放因子，得到TPM。(再将第一步得到的每个基因的RPK除以第二部计算的缩放因子，最终得到TPM值。)

CPM

CPM（Counts Per Million, or Counts of exon model Per Million mapped reads） 每百万映射读取的counts

原始的表达量除以该样本表达量的总和，再乘以一百万，即可得到CPM值。CPM值只对测序深度进行了标准化

参考

RPKM, FPKM and TPM, clearly explained
RPKM、FPKM 和 TPM，解释清楚
【生物信息】RPKM, FPKM和TPM