单细胞转录组（3）-EW帮帮网

1. 安装软件

为了进行单细胞测序数据分析，需要安装一系列专业的软件工具。以下是一些常用的软件及其安装方法：

1.1 Cell Ranger 下载安装（需注册）

Cell Ranger 是 10x Genomics 提供的官方数据分析软件，它支持从原始测序数据（FASTQ 或 BCL 格式）到基因表达矩阵的生成，并提供聚类、降维等分析功能。

访问下载地址：
- Cell Ranger 官方下载页面
- 您需要注册账号并登录才能下载。
  三种下载方式

curl -o cellranger-9.0.1.tar.xz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-9.0.1.tar.xz?Expires=1747586436&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=XkJhGkGvdyxcIIVO6RZpQH2kKThwPkG0vxG6HWR5~Xx5x-OBs-V-gMzDrcwEIqqw8nQUD8V3X4vtDZmpDBJuypuJ00mDi--9zQ70VTXnFvffe0w6bPV-YuQsdmXfN4zI6rA751DCG7blReDDPRgftXlYxTW6-wyryidmFiP3ZQwq6a2qKCB9ZwzSb1hNJmIbsGM21ebMjyqxqMBxL04MxBTT2C33-Ie3EtB2tH40EJLAPfD3VMzTxwHU7if-bZ08Z~Dr6TKx-12gkN8uOPvJsKiLLqa27PO6OijgzD3QKvKIXF~eLQRQMyE035Nz7Xry9cZn7r80ZyLj~v5zp7rrUA__"

tar -xvf cellranger-9.0.1.tar.xz

export PATH=/public/home/2022099/public_software/cellranger/cellranger-9.0.1:$PATH

#输出如下
cellranger
cellranger cellranger-9.0.1

Process 10x Genomics Gene Expression, Feature Barcode, and Immune Profiling data

Usage: cellranger <COMMAND>

......

安装步骤：

访问上述链接，注册账号并登录。
根据操作系统选择合适的版本下载。
解压下载的文件，并按照安装说明进行安装。
安装完成后，可以通过命令行运行 cellranger --version 来验证安装是否成功。

1.2 Loupe Browser 下载（需注册）

Loupe Browser 是 10x Genomics 提供的可视化工具，用于查看和分析 Cell Ranger 生成的结果文件（如 .cloupe 文件）。

访问下载地址：
- Loupe Browser 官方下载页面
- 您需要注册账号并登录才能下载。
安装步骤：
1. 访问上述链接，注册账号并登录。
2. 根据操作系统选择合适的版本下载。
3. 安装完成后，启动 Loupe Browser 并按照提示进行配置。

1.3 bcl2fastq 不好下，一般返回的是fastq，也不需要下

bcl2fastq 是 Illumina 提供的软件，用于将 BCL 格式的测序数据转换为 FASTQ 格式，这是单细胞测序数据分析的前置步骤。

访问下载地址：
- Illumina bcl2fastq 下载页面
安装步骤：
1. 访问上述链接，下载对应版本的软件。
2. 解压下载的文件，并按照安装说明进行安装。
3. 安装完成后，可以通过命令行运行 bcl2fastq --version 来验证安装是否成功。

1.4 其他软件

除了上述软件，还可能需要安装一些其他工具，例如用于比对的 STAR、用于定量的 featureCounts 等。可以通过以下命令安装这些工具（使用 Conda 环境管理工具）：

mamba install -y star featurecounts samtools r-seurat umi_tools

2. 下载参考序列

为了进行单细胞测序数据分析，需要使用参考基因组。参考基因组提供了基因组的背景信息，这对于比对测序数据和定量基因表达至关重要。10x Genomics 提供了针对不同物种的参考基因组，可以直接用于 Cell Ranger 分析。

2.1 访问下载地址

您可以通过以下链接访问 10x Genomics 参考基因组下载页面：
- 10x Genomics 参考基因组下载页面

2.2 下载参考基因组

人类参考基因组（GRCh38）：
- 您可以通过以下命令下载人类参考基因组（GRCh38）：
```
curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz"
```
小鼠参考基因组（GRCm39）：
- 您可以通过以下命令下载小鼠参考基因组（GRCm39）：
```
curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCm39-2024-A.tar.gz"
```
大鼠参考基因组（mRatBN7.2）：
- 您可以通过以下命令下载大鼠参考基因组（mRatBN7.2）：
```
curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mRatBN7-2-2024-A.tar.gz"
```

2.3 解压下载的文件

下载完成后，您需要解压缩下载的文件到指定目录。这通常可以通过以下命令完成：
```
tar -xzf refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz -C /path/to/installation/directory
```
- 请将 /path/to/installation/directory 替换为您希望解压缩文件的实际路径。

3. 自建参考序列

对于非模式物种或者当需要特定版本的参考基因组时，研究人员可能需要自己构建参考基因组。以下是构建参考基因组的一般步骤：

3.1 斑马鱼参考基因组构建

以斑马鱼（zebrafish）为例，说明如何构建参考基因组：

下载基因组序列：

wget http://ftp.ensembl.org/pub/release-105/fasta/danio_rerio/dna/Danio_rerio.GRCz11.dna.primary_assembly.fa.gz
gunzip Danio_rerio.GRCz11.dna.primary_assembly.fa.gz

这一步下载斑马鱼的基因组序列。

下载GTF文件：

wget http://ftp.ensembl.org/pub/release-105/gtf/danio_rerio/Danio_rerio.GRCz11.105.gtf.gz
gunzip Danio_rerio.GRCz11.105.gtf.gz

这一步下载斑马鱼的GTF（Gene Transfer Format）文件，它包含了基因的注释信息。

过滤GTF文件：

cellranger mkgtf Danio_rerio.GRCz11.105.gtf Danio_rerio.GRCz11.105.filtered.gtf --attribute=gene_biotype:protein_coding

使用Cell Ranger 的 mkgtf 命令过滤GTF文件，只保留编码蛋白的基因。

构建参考序列：

cellranger mkref --genome=Danio_rerio --fasta=Danio_rerio.GRCz11.dna.primary_assembly.fa --genes=Danio_rerio.GRCz11.105.filtered.gtf

使用Cell Ranger 的 mkref 命令构建参考序列。

3.2 猕猴基因组构建

对于猕猴（Rhesus macaque）等其他物种，步骤与斑马鱼类似，需要下载对应的基因组序列和GTF文件，然后进行过滤和构建参考序列。

3.3 大鼠参考基因组构建

对于大鼠（Rattus norvegicus）等物种，同样的流程适用。需要下载大鼠的基因组序列和GTF文件，过滤GTF文件，最后构建参考序列。

4. 下载练习数据

为了熟悉单细胞测序数据分析流程，可以使用10x Genomics提供的练习数据。这些数据通常来自已发表的文章，可以直接用于学习和练习。

4.1 访问下载地址

您可以通过以下链接访问10x Genomics数据下载页面：
- 10x Genomics 数据下载页面

4.2 下载练习数据集

练习数据集通常包括原始测序数据（FASTQ格式）、参考基因组以及分析结果文件（如.cloupe文件）。
您需要注册并登录10x Genomics网站，然后根据研究类型、试剂版本和流程版本筛选并下载所需的数据集。

4.3 下载示例

以下是下载练习数据的示例命令：

# 下载原始测序数据（FASTQ格式）
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_fastqs.tar

# 下载比对排序后的BAM文件
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_possorted_genome_bam.bam

# 下载分析结果文件（.cloupe格式）
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_molecule_info.h5
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_filtered_feature_bc_matrix.h5

4.4 数据解压缩

下载完成后，您可能需要解压缩下载的文件。这通常可以通过以下命令完成：
```
tar -xvf pbmc_1k_v3_fastqs.tar
```
- 这将解压FASTQ文件，使其可用于后续分析。

4.5 准备分析环境

确保您已经安装了所有必要的软件，如Cell Ranger、Loupe Browser等。
将下载的数据放置在合适的目录中，准备进行分析。

5. 单细胞学习案例

为了更好地掌握单细胞测序数据分析，参考一些在线教程和案例是非常有帮助的。以下是一些推荐的学习资源：

5.1 单细胞公开课

Single Cell Course 提供了一个全面的单细胞测序数据分析教程，适合初学者和有经验的研究人员。
- 网址：Single Cell Course
- 这个课程涵盖了从基础到高级的单细胞分析技术，包括数据预处理、分析和可视化。

5.2 Cell Ranger 案例

Getting Started with Cell Ranger 是一个实用的教程，指导如何使用 Cell Ranger 软件进行数据分析。
- 网址：Cell Ranger 教程
- 这个教程详细介绍了 Cell Ranger 的安装、使用和结果解读。

5.3 10x Genomics 官方教程

10x Genomics 官方网站提供了丰富的文档和教程，帮助用户理解其产品和分析流程。
- 网址：10x Genomics Support
- 官方支持页面包含了软件下载、安装指南、分析流程和常见问题解答。

5.4 Seurat 教程

Seurat 是一个流行的单细胞分析 R 包，它的文档提供了如何使用 Seurat 进行高级分析的指南。
- 网址：Seurat 文档
- Seurat 文档详细介绍了如何进行数据导入、预处理、分析和可视化。

5.5 单细胞最佳实践

Single Cell Best Practices 是一个GitHub仓库，包含了单细胞分析的最佳实践和教程。
- 网址：Single Cell Best Practices
- 这个资源提供了一系列的分析脚本和案例，帮助用户理解单细胞分析的各个步骤。

5.6 其他资源

Seurat 社区：Seurat 用户和开发者社区，提供了许多有用的讨论和教程。
Biostars：一个科研人员评价和讨论生物信息学工具的平台，上面有许多关于单细胞测序工具的讨论。
ResearchGate：一个科研社交网络，用户可以在这里找到相关的研究论文、数据集和讨论。

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