近日，中国科学院植物研究所植物园王利军研究员团队在Nature communications期刊发表研究论文《A naturally occurring SNP modulates thermotolerance divergence among grapevines》，该研究利用GWAS和RNA-seq鉴定到葡萄耐热性的一个关键基因TTC4，然后利用DAP-seq找到了它的两个靶基因HSP18.1和APX3。同时，关联分析及相关验证表明TTC4内含子中的SNP变异调控葡萄耐热性。爱基百客为该研究提供DAP-seq的技术支持。
研究背景
全球气候变暖导致的高温胁迫严重威胁葡萄产业可持续发展，但葡萄耐热性的遗传基础尚未阐明。其阐明难度在于准确评估表型和相关遗传途径的复杂性。此前，研究团队开发了一种快速且准确的方法来评估葡萄的耐热性，证明了像V.davidii和V.quinquangularis这样的野生葡萄品种，尽管经济性状不佳，但通常表现出更强的耐热性，这些野生葡萄原产于中国较温暖的地区。为了深入地了解葡萄的耐热性，探索并评估耐热种质资源的本土多样性至关重要。
研究思路
研究结果
1. TTC4的鉴定和表征
为了研究与葡萄耐热性相关的遗传多样性，研究评估了121个葡萄品种的耐热性。通过测量叶片的叶绿素α荧光值Fv/Fm，来评估耐热性。如预期所示，V. vinifera品种的Fv/Fm值显著低于V. vinifera与野生种杂交的品种及野生种的品种（P < 0.05）（图1a）。同时对这121个品种进行重测序，鉴定出与Fv/Fm值显著相关的位于第4号染色体上15个位点，以及位于第7号染色体上1个位点（图1b, c）。在4号染色体位点上预测到121个基因，然而在已发表的转录组数据中仅检测到97个基因在不同高温条件下存在。
通过比较RNA-seq的表达水平，找到了16个高温上调基因，并经过qRT-PCR分析，VIT_204s0043g00820 和 VIT_204s0023g00470 的表达在TW和JX的高温条件下明显增加（图 1e）。对这两个基因进行鉴定分析，研究重点放在了VIT_204s0023g00470上。研究团队将 VIT_204s0023g00470（其编码1个WRKY转录因子）命名为TTC4（位于4号染色体的耐热性基因），并将来自V. davidii ‘Tangwei’（TW）的TTC4 设计为 TTC4TW，将来自V. vinifera ‘Jingxiu’（JX）的TTC4设计为TTC4JX。
图1: 葡萄藤耐热遗传的分析及TTC4的克隆
2. TTC4赋予葡萄耐热性
为了验证TTC4的功能，在葡萄苗中进行瞬时过表达和RNAi实验。在高温条件下，相比EV对照组OE-TTC4TW和OE-TTC4JX苗的相对电解质泄漏更低，Fv/Fm值更高（图2a–c）。TTC4 RNAi载体转化的Y2苗中的TTC4下调，并且与对照组相比，在高温下表现出更高的相对电解质泄漏和较低的Fv/Fm值（图2d–f）。
为了进一步验证TTC4TW和TTC4JX的功能，研究在‘41B’（V. vinifera ‘Chasselas’ × V. berlandieri）葡萄悬浮细胞中稳定过表达了它们。与EV悬浮细胞相比，OE-TTC4TW和OE-TTC4JX显著提高了细胞存活率，并在热处理和恢复后增加了悬浮细胞的鲜重（图2g, h）。这些发现表明，TTC4TW和TTC4JX均赋予了葡萄热耐受性。
图2：TTC4赋予葡萄耐热性
3. TTC4激活HSP18.1和APX3的表达
为了阐明TTC4介导的葡萄藤热耐受性的分子机制，研究利用DAP-seq技术，使用TTC4TW蛋白，分析了TTC4结合的基因上下游各2kb区域，结果显示结合位点在启动子区域显著集中（图3a）；94.56%的峰位于启动子中，而其余的峰分布在内含子、编码区及3’和5’UTR（图3b）。基于TTC4结合区域进行了de novo基序预测，在TTC4结合峰中识别到了一些富集的基序。除了WRKY蛋白通常结合的核心元件TGAC外，还识别到了其他TTC4可能结合的元件，如ACGTGG和ACTTA（A/T/G）TA（图3c）。
图3: TTC4直接激活HSP18.1和APX3的表达。
热休克蛋白（HSPs）和抗氧化酶在植物耐热胁迫中发挥着重要作用。因此，研究专注于分析TTC4靶向基因中HSP和抗氧化酶基因的富集情况。结果表明，HSP18.1和APX3在HSP和过氧化物酶中表现出最高的富集倍数，因此选择它们进行进一步分析。为了验证这两个靶基因，研究进行了酵母单杂、EMSA、双荧光素酶报告和qRT-PCR等实验。结果表明TTC4能够激活葡萄中HSP18.1和APX3基因的表达。
4. HSP18.1和APX3正向影响葡萄的耐热性
为了阐明HSP18.1和APX3在葡萄耐热性中的作用，研究在葡萄藤中瞬时过表达这些基因并通过RNAi干扰抑制其表达。与EV植株相比，过表达HSP18.1或APX3的葡萄叶在热胁迫下表现出显著更低的相对电解质泄漏和更高的Fv/Fm值（图4e–g）。此外，同时构建HSP18.1和APX3的RNAi载体，并瞬时转化到Y2葡萄叶中。在高温下观察到SiHSP18.1和SiAPX3的相对电解质泄漏增加和Fv/Fm值降低（图4h–j）。这些结果支持HSP18.1和APX3都正向影响葡萄藤耐热性的观点。
图4: HSP18.1和APX3对葡萄耐热性有正向调控作用
5. TTC4的2号内含子的自然变异影响其表达
尽管TTC4TW和TTC4JX在基因特征和功能上几乎相同（图1g、图2），但它们对高温的表达响应截然不同（图1d、e）。由此引发了一个有趣的问题：TTC4序列内的遗传变异是否导致了TW和JX中TTC4表达差异？
为了精确定位TTC4序列中的关键位点，研究在121个葡萄种质材料中，对TTC4的遗传变异与Fv/Fm值进行了关联分析。结果显示，位于启动子区的SNP（–617）和第2内含子上的SNP（7631）与Fv/Fm值显著相关（图5a）。为了筛选决定TTC4表达水平的序列区域，研究将启动子、各内含子及其融合序列克隆至pGreenII-0800-LUC载体，并在烟草中进行了瞬时表达（图5b）。相对荧光素酶活性的结果让研究团队推测TTC4TW与TTC4JX的int2-2在顺式元件上的差异导致了基因表达调控的差异。
另外值得注意，在GTAC(T)元件中鉴定到了SNP（7631）。为进一步评估SNP-C/T（7631）对TTC4表达的影响，研究采用农杆菌浸润法，将携带由TTC4TW或TTC4JX int2-2驱动的LUC报告基因的构建体导入植物中。当将int2-2JX中的C（7631）替换为T（7631）后，其调控基因表达的能力显著增强；相反，将int2-2TW中的T（7631）突变为C（7631）后，其调控TTC4表达的能力显著降低（图5f）。此外，高温可诱导TTC4int2-2对基因表达的调控能力（图5f）。这些结果表明，TTC4内含子中的SNP-C/T（7631）作为关键变异位点，显著影响TTC4的表达水平。
图5: TTC4内含子的自然变异影响了TTC4的表达
6. SPL13抑制TTC4 C（7631）的表达
TTC4 int2-2中7631位点的C/T单核苷酸多态性变异促使研究团队寻找可结合该位点的转录因子。7631的C等位基因位于GTAC顺式元件，该元件可被SPL家族转录因子识别。利用植物转录调控图谱（PlantRegMap）进行结合位点预测，研究鉴定出六个可能结合GTAC(7631)但不结合GTAT(7631)的转录因子：SPL1、SPL3、SPL9、SPL13、SPL14和GATA25。酵母单杂和EMSA表明仅SPL13能直接结合int2-2-TTC4C(7631)（图6b）。此外，在高温条件下，TW和JX葡萄品系中SPL13的表达水平下降。因此，研究选择SPL13进行进一步研究。
为了进一步研究SPL13在调控int2-2-TTC4T(7631)和int2-2-TTC4C(7631)基因表达中的作用，研究在烟草叶片中进行了双荧光素酶报告基因测定。结果表明SPL13既不激活也不抑制int2-2-TTC4T(7631)（图6c）；然而，SPL13显著抑制了int2-2-TTC4C(7631)（图6d）。为验证SPL13在葡萄耐热性中的作用，在JX葡萄叶片中过表达了SPL13（OE-SPL13）。在JX葡萄幼苗中瞬时过表达SPL13的植株中，TTC4C(7631)的表达显著下调。与空载体（EV）转化的幼苗相比，OE-SPL13幼苗在高温胁迫下表现出更高的相对电解质渗漏率和更低的Fv/Fm值（图6e–g），表明过表达SPL13会降低植物的耐热性。总之，研究结果表明SPL13通过结合int2-2-TTC4C(7631)抑制TTC4表达，从而作为葡萄耐热性的负调控因子。相反，TTC4T(7631)通过阻止SPL13与int2-2结合，减轻了这种抑制作用。
图6：SPL13直接抑制TTC4C（7631）的表达。
7. TTC4的自然变异导致葡萄群体中耐热性的分化
为分析121份葡萄种质资源中TTC4的自然变异，作者进行了主成分分析（PCA）。结果显示前两个主成分分别解释了总遗传变异的58.72%和10.28%（图7a）。随后通过进化分析探究该基因在种质资源间的变异规律，发现耐热野生种质通常与热敏感的欧亚种葡萄（V. vinifera）种质存在显著差异（图7b）。进一步比较野生种、欧亚种与野生种的杂交种以及欧亚种葡萄的TTC4核苷酸多样性，发现包含TTC4的10 kb区域内，欧亚种葡萄的平均核苷酸多样性（π = 0.07347）显著低于杂交种（π = 0.13638）和野生种（π = 0.16317）（图7c）。与此一致，欧亚种葡萄种质中检测到显著的Tajima’s D值（图7d）。单倍型网络分析显示野生种的TTC4单倍型与欧亚种葡萄遗传距离显著更远（图7e）。此外，野生种中TTC4的单倍型T（7631）占比显著高于欧亚种葡萄（图7f）。
为进一步研究SNP-C/T (7631) 对葡萄耐热性的影响，研究团队基于耐热性（Fv/Fm值）对两个天然种群和两个杂交后代群体进行了基因型分析。在华南地区南宁市种植的121份葡萄材料中，携带T/T或C/T基因型的材料较C/C基因型材料表现出更高的耐热性（图7g）。在华北地区北京种植的84份葡萄材料（图7h）中也观察到一致结果。此外，研究团队在华南地区南宁市对携带C/T基因型的“Guipu1”(V. quinquangularis × V. vinifera)和携带C/C基因型的“赤霞珠”(V. vinifera)及其杂交后代进行了研究。结果显示，携带C/C基因型的材料耐热性显著低于携带C/T基因型的材料（图7i）。同时，在华北地区郑州市种植的“美人指”(V. vinifera，携带C/C基因型)和“0940”(V. davidii，携带T/T基因型)及其杂交后代中也观察到类似结果（图7j）。
图7: TTC4的自然变异导致葡萄群体中耐热性的分化
研究结论
研究发现基因TTC4正向调节葡萄耐热性，其机制可能是通过上调HSP18.1和APX3。TTC4受到至少三种机制的调控。首先，高温抑制TTC4的抑制因子SPL13。其次，SPL13识别并结合TTC4 int2-2内含子中的GTAC元件，从而抑制TTC4。然而，TTC4 int2-2内含子7631位点由C到T的自然变异阻止了SPL13的结合，导致TTC4解除抑制。此外，TTC4T(7631)的内含子调控能力显著强于TTC4C(7631)，进一步增强了基因表达。这种精细调控促成了葡萄种群耐热性差异的形成（图8所示）。TTC4的发现为解析葡萄耐热性的分子机制提供了宝贵的见解，也为葡萄及其他作物的分子育种提供了潜在的应用价值。
图8:葡萄藤SPL13-TTC4-HSP18.1/APX3介导的耐热性分歧的模型。
