I型限制-修饰（RM）系统由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，主要通过甲基化宿主DNA来抵御外来DNA入侵，但其在进化过程中的稳定遗传机制和功能尚不清楚。
2025年7月12日，海南大学李宏教授、云南农业大学刘柱教授共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=13.1）在线发表题为“Horizontal acquisition of the Type I restriction–modification system enhances bacterial pathogenicity by mediating methylation of transcription factor-encoding genes”的研究论文。该研究建立了一个完整的进化-功能范式，阐明了RMS在细菌基因组中稳定遗传的方式（进化轨迹）及原因（功能限制），并揭示了RMS调控细菌致病性的分子机制。爱基百客为本研究提供了甲基化测序技术支持。
研究结果
1. I型限制-修饰（RM）系统在原核生物中的多样分布
在4273个原核基因组（4019细菌、254古菌）中，64.6%、75.5%、60.2%的物种分别携带hsdR、hsdM、hsdS基因，平均每个物种含1.8个hsdR、2.3个hsdM、2.0个hsdS，提示这些基因经历过复制或水平基因转移（HGT）（Fig.1A）。在这些基因组中共鉴定出四种I型RM系统基因排布：RMS、RSM、R-MS（hsdR与hsdMS间插入≤5个基因）、R-SM（Fig.1B）。在细菌中，RMS最常见，而古菌则以R-MS/R-SM为主（Fig.1C）。
为了进行更详细的分析，在不同的门上计算了4种I型RM系统的频率：细菌中，RMS在Fusobacteriota、Desulfobacterota富集（>0.2个/种），RSM在Firmicutes、Actinobacteriota等富集，R-SM在Campylobacterota、Planctomycetota等富集（>0.2个/种）；古菌中所有类型频率均<0.2个/种（Fig.1D）。此外，研究发现RMS与前噬菌体频率正相关，提示噬菌体可能介导RMS的水平传播（Fig.1E）。
Fig 1.I型RM系统和前噬菌体在原核生物中的分布
2. I型限制-修饰（RM）系统的分布与菌株的生态位相关
为解析种内I型RM系统的分布规律，选择A. veronii作为模型生物，分析了42株菌（Fig.2A）。分析显示，I型RM系统的有无及类型在菌株间差异巨大，水源株系统数显著高于人源株，泰国株普遍缺失。系统类型以RMS和R-SM为主，其中RMS的hsdR/M/S基因在进化树上高度聚类且支长极短，显示遗传稳定性；R-SM相关基因分散多支并夹杂非系统残片，暗示经水平转移后部分断裂（Fig.2B）。水源株同时携带更多前噬菌体（平均3.1个），提示生态位、地理隔离及噬菌体介导的水平基因转移共同塑造了A. veronii中I型RM系统的多样性格局。
Fig 2. A. veronii 菌株中I型限制-修饰（RM）系统和前噬菌体的分布
3. RMS经历了一个漫长而复杂的进化过程
通过对携带RMS的物种及hsdR、hsdM、hsdS基因的系统发育树分析（Fig.3A和3B），物种树与基因树之间存在明显不同的拓扑结构，这表明这些基因主要通过原核生物之间的水平基因转移（HGT）进化。这一结论进一步得到了核苷酸组成分析的支持，该分析显示水平转移的hsd基因与其受体基因组的GC含量之间存在显著偏差。相比之下，这些基因发生复制的事件相对较少，仅在厚壁菌门的三个物种中出现（Fig.3C）。这三种基因的基因树均呈I–V五大谱系，谱系内部物种组成高度重合，提示共同进化史；其中Desulfobacterota和Cyanobacteria常作为祖先节点，暗示其为RMS跨门转移的早期供体（Fig.3B）。综合模型认为RMS经历了“祖先基因复制→跨物种水平转移→宿主内垂直遗传或基因丢失→hsdR/M/S逐步紧密连锁”这一漫长而复杂的过程（Fig.3D），但仍需实验进化研究加以验证。
Fig 3. RMS的系统发育分析
4. ΔRMS菌株缺乏鞭毛，表现出毒力减弱的表型
为了探索RMS在稳定遗传后发挥的功能作用，研究构建了A. veronii C4的ΔRMS和ΔRMS/pRMS菌株。通过透射电子显微镜（TEM）观察显示，三种菌株的细胞大小相似，末端呈圆形，与WT野生型菌株相比，ΔRMS菌株和ΔRMS/pRMS菌株均缺乏极性鞭毛，表明RMS可能并不直接调控鞭毛组装（Fig.4A）。进一步使用野生型、ΔRMS或ΔRMS/pRMS菌株感染健康的实验小鼠（Fig.4B），在小鼠各个器官（尤其是肾脏）菌株定植能力表现为：WT>ΔRMS/pRMS>ΔRMS（Fig.4C）。组织病理学分析显示，感染WT菌株的小鼠肾脏出现严重的肾毒性，包括肾小管扩张、肾小球肿胀、细胞坏死、核固缩和间质性充血，在脾脏和肝脏中也观察到类似的病变；ΔRMS/pRMS菌株引起了肾小管扩张、脾脏炎症和肝细胞损伤，毒力低于WT菌株；感染ΔRMS菌株的小鼠并未出现明显的病理变化（Fig.4D）。结果表明，表明RMS在调节细菌致病性中起关键作用。
Fig 4. RMS对细菌致病性的影响
5. RMS通过甲基化转录因子编码基因来调节下游基因的表达
为了探究RMS调控细菌致病性的分子机制，对野生型（WT）和ΔRMS菌株的转录组和甲基化组进行了测序。与WT菌株相比，ΔRMS菌株中有167个基因表达差异显著，这些基因在鞭毛组装、细菌趋化等相关通路中显著富集（Fig.5A）。这些差异表达基因（DEGs）倾向于在基因组中聚集，形成编码鞭毛组装和趋化相关蛋白的基因簇（Fig.5B）。这一发现表明，DEGs可能通过某些转录因子（TFs）共同调控。在野生型菌株中，鉴定出7对甲基化motif，ΔRMS菌株仅表现出五对。在ΔRMS菌株中缺失的motif 5′-GTANNNNNNNNCTTC-3′↔5′-GAAGNNNNNNNNTAC-3′（下划线表示甲基化碱基）是RMS的靶位点（Fig.5C）。基因组中总共有386个序列与RMS靶位点匹配，其中330个序列位于316个蛋白编码基因的基因体内，显著富集于氨基酸代谢和跨膜运输功能。
Fig 5. RMS调控的通路
在316个含RMS靶位点的基因中，16个编码转录因子（TFs），其中9个活性TF通过保守基序被RMS直接甲基化后显著下调，进而使其共同调控的89个缺乏RMS位点的下游基因（鞭毛flg、趋化che等）表达降低，RT-qPCR证实关键TF（rpoN、rpoS和flrA）及其靶基因均显著下调（Fig.6A），揭示RMS通过“甲基化-TF-靶基因”级联间接抑制鞭毛与趋化系统，从而削弱细菌致病力（Fig.6B）。
Fig 6. RMS调控鞭毛组装和趋化的假设性调控模型
研究结论
本文研究了I型限制-修饰（RM）系统在原核生物中的分布、进化及其对细菌致病性的调控机制。研究发现，I型RM系统在4273个原核基因组中存在四种主要类型，其中RMS（5′-hsdR, hsdM, hsdS-3′）是最进化的形式。RMS通过基因复制、水平基因转移和基因丢失形成，并在细菌中稳定存在。功能研究表明，RMS缺失会导致细菌失去鞭毛，显著降低其在小鼠体内的定殖和感染能力。多组学分析揭示了RMS通过DNA甲基化调控转录因子的表达，进而影响下游鞭毛和趋化基因的表达，最终影响细菌的致病性。这些发现阐明了RMS在细菌基因组中稳定遗传的进化和功能机制，揭示了其通过表观遗传调控影响细菌致病性的分子机制。
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