文章信息
题目：The Conserved and Particular Roles of the R2R3-MYB Regulator FhPAP1 from Freesia hybrida in Flower Anthocyanin Biosynthesis
刊名：Plant and Cell Physiology
作者：Yueqing Li, Xiang Gao
单位：Northeast Normal University
01
摘要
花青素生物合成主要由调节花青素生物合成基因 (ABGs) 表达的 MYB-bHLH-WD40 (MBW) 复合物控制。参与花青素生物合成的 MYB 调节剂在植物进化早期出现，因此可能在不同的谱系中发挥不同的作用。尽管人们已对双子叶植物中促进花青素的 R2R3-MYB 调节剂进行了全面探索，但在不同植物谱系的 MYB 调节剂之间的功能差异与保护之间几乎没有达成共识。在这里，我们整合了转录组分析、基因表达谱、功能获得实验和瞬时原生质体转染试验，在功能上表征单子叶植物香雪兰与 ABG 的相关性。当 FhPAP1 分别在香雪兰、拟南芥和烟草中过表达时，可以激活 ABG 以及 TT8 相关基因FhTT8L、AtTT8和NtAN1 。FhPAP1 可以与 FhTT8L 和 FhTTG1 相互作用形成保守的 MBW 复合物，并与其来自拟南芥的直系同源物共享相似的靶基因。FhPAP1 显示出比拟南芥和烟草中的同源物更高的反式激活能力。此外，我们发现FhPAP1种产生密集的花色素沉着。这些结果表明，虽然 MBW 复合物在测试的单子叶植物和双子叶植物之间具有高度进化保守性，但参与的 MYB 调节因子根据其激活域显示出反式激活能力的功能差异。
02
技术路线
03
主要结果
3.1 FhPAP1基因的分离和序列分析
通过对F. hybrida完整转录组数据的 BLAST 分析，发现一个序列编码与拟南芥 AtPAP1 同源性很高的 R2R3-MYB 转录因子，随后命名为FhPAP1（图 1A，GenBank 登录号MT210093）。FhPAP1的 702 bp 开放阅读框编码了一个由 233 个氨基酸组成的蛋白质，与拟南芥 AtPAP1 有 55% 的同源性性。氨基酸序列比对显示保守基序 [D/E]Lx 2 [R/K]x 3 Lx 6 Lx 3 R 存在于 FhPAP1 的 R3 结构域中，这被认为是在与 R/B 相互作用中起重要作用类 bHLH 调节剂。参与双子叶植物中花青素积累的 134 个 MYB 调节因子的比对在 R3 重复序列中显示出高度保守的精氨酸 (R)、缬氨酸 (V) 和丙氨酸 (A) 残基。本研究表明，单子叶植物香雪兰中的特征并不总是保守的。因为残基 V 被 D 取代，ANDV 中的 V 被 FhPAP1 中的 I 取代。
为了更好地定义 FhPAP1，构建了一个包含已知黄酮类 MYB 调节剂的系统发育树（图 1B）。在系统发育中产生了许多进化枝，这些进化枝暗示了它们的不同功能。FhPAP1 属于花青素进化枝，与 LhMYB6处于同一分支，它以前被确定为百合杂种中的花青素调节剂。这些结果表明FhPAP1可能编码F. hybrida中推定的 R2R3-MYB 花青素调节剂。
3.2 FhPAP1的表达主要与F. hybrida花色苷生物合成中的 LBGs 相关
在香雪兰中，花青素主要在花瓣中合成，并在花发育过程中逐渐积累。为了评估FhPAP1的表达模式是否在时间和空间上与F. hybrida中的花青素积累相伴，在五个发育阶段八个组织中检查了FhPAP1的转录本。FhPAP1的表达水平在花中从绿芽期到盛开期增加了近 30 倍（图 2A）。此外，FhPAP1在花青素过度积累的花瓣中高度表达，而在其他组织中表达水平较低（图2B）。这些结果强烈暗示FhPAP1可能在调节花青素生物合成中起作用。
为了评估FhPAP1和合适的结构基因之间假定的转录关联，鉴定了 14 个候选基因，并通过qRT-PCR确定了它们的时间表达谱。热图可视化了负责类黄酮生物合成的基因表达模式（图 2C）。结果表明，FhPAP1主要与LBGs聚集，在花发育过程中表现出逐渐增加的表达模式。其他三个花青素相关基因FhGL3L、FhTT8L和FhTTG1的表达也在花发育过程中也被检测到。结果表明，FhTT8L和FhTTG1与FhPAP1具有相似的表达模式，这表明它们可能在香雪兰花青素生物合成过程中协同作用。
3.3 FhPAP1 促进F. hybrida和其他植物中的花青素生物合成
为了解释FhPAP1在花青素生物合成中的调控功能，首先用过表达FhPAP1的载体瞬时转染从 Red River 愈伤组织中分离的小苍兰原生质体。正如预期的那样， FhPAP1显着增加了花青素途径中的LBG ，这证实了它们在花发育过程中的同时表达（图 3A）。有趣的是，EBGs 和FhTT8L也被激活，呈现出多倍的增加（图 3A）。为了进一步证实 FhPAP1 可以促进花青素积累，采用了另一种具有白色花朵的小苍兰栽培品种 Ambiance。如图所示图3B，所有结构基因的转录本，尤其是LBGs，以及FhPAP1和FhTT8L，在Ambiance花中都处于相当低的水平（图3B）。将含有FhPAP1的农杆菌菌株注射到 Ambiance 芽中会导致花瓣颜色变深并增加花青素含量（图 3C、D）。这些结果表明 FhPAP1 促进F. hybrida中的花青素生物合成。
为了进一步验证 FhPAP1 在调节花青素生物合成中的功能，选择拟南芥和烟草进行遗传转化试验。拟南芥中FhPAP1的过表达导致色素在不同组织和器官中的积累增加。代谢物分析表明，来自FhPAP1表达系的 4 周龄莲座叶比对照植物积累了更多的花青素和 PAs。与转基因植物中花青素的积累一致，内源EBGs和LBGs都被显着激活。此外，在转基因烟草植物的不同组织中观察到多种花青素和 PAs 的超累计，与野生型植物相比，几乎所有的 ABGs 都被激活。除结构基因外，还测定了转基因植物中 MBW 成分基因的表达。发现AtTT8基因表达增加约 200 倍，同时其他调节基因略有增加。此外，当NtAN1被激活时，内源性结构基因的上调最为明显总之，FhPAP1 在小苍兰和其他植物中在调节花青素生物合成方面是功能保守的。
3.4 FhPAP1 与 FhTT8L 和 FhTTG1 相互作用以控制F. hybrida中的花青素生物合成
为了更深入地了解小苍兰中潜在的 MBW 复合物，使用基于 Gal4 的瞬时转染系统在野生型拟南芥原生质体中直接评估 FhPAP1、FhTT8L 和 FhTTG1 蛋白之间的分子相互作用。FhPAP1、FhTT8L 和 FhTTG1 的反式激活能力首先通过与酵母 GD（Gal4 DNA 结合域）标签融合然后与Gal4共转染来检测：GUS（Gal4 DNA 结合位点促进 GUS 报告质粒）进入拟南芥原生质体. 融合蛋白将通过 GD 结构域与 Gal4 DNA 结合位点结合，然后当融合因子为激活剂时驱动GUS表达。值得注意的是，与 FhTT8L 和 FhTTG1 相比，GD 标记的 FhPAP1 能够显着促进 GUS 活性，表明 FhPAP1 是一种激活剂（图 4A）。随后，用HA标签替代GD-FhPAP1中的GD标签构建HA-FhPAP1，其不能促进Gal4：GUS表达缺乏与 Gal4 位点的结合域。当 GD 标记的 FhTT8L 或 FhTTG1 与 FhPAP1 相互作用时，反式激活因子 FhPAP1 将再次被募集到 Gal4 DNA 结合位点，然后导致GUS表达，表明 FhPAP1 可以与 FhTT8L 和 FhTTG1 蛋白相互作用（图 4B）。结果表明 FhTT8L 对 FhTTG1 或 FhTT8L 具有很强的亲和力（图 4C，D）。此外，这些蛋白质之间的所有相互作用都通过生物分子荧光互补 (BiFC) 测定重新验证（图 4E）。综合考虑这些相互作用，FhPAP1-FhTT8L-FhTTG1 复合物似乎确实在小苍兰花青素生物合成中起作用。
04
结论
总之，FhPAP1 和 AtPAP1 可能能够激活 ABG 和 bHLH 辅助因子。表达的 bHLH 因子与 WD40 蛋白一起可以显着增强 FhPAP1 对 ABGs 的激活作用。因此，提出了FhPAP1参与F. hybrida花色素沉着的转录调控模型（图9）。随着 Red River 中的花发育，FhPAP1 和 FhTTG1 可能会被初始化，并且 MYB 调节器会激活 ABGs 和FhTT8L的转录本。FhTT8L 进一步与 FhPAP1 和 FhTTG1 共同作用形成 MBW 复合物，可增强FhTT8L的表达。增加的 MBW 复合物也可以显着激活 ABG 的转录本。该系列最终导致花青素积累。然而，由于FhPAP1和FhTT8L在 Ambiance中的低表达，ABG 可能无法达到导致花青素生物合成的阈值。
这是首次对来自杂种植物花青素生物合成相关的 MYB 调控基因的研究，阐明了该单子叶植物花色素积累的遗传、进化和驯化基础的理论。数据表明，负责花青素生物合成的 MBW 复合物可能在被子植物中高度保守。然而，MYB 调节剂对其靶基因的调节作用可能在很大程度上受到它们的反式激活能力以及它们在 MBW 复合物中的 bHLH 蛋白的影响。FhPAP1 异常高的反式激活能力赋予了在许多其他植物中改变花或营养器官色素累计的潜在能力。
05
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题目：The Conserved and Particular Roles of the R2R3-MYB Regulator FhPAP1 from Freesia hybrida in Flower Anthocyanin Biosynthesis
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01
摘要
花青素生物合成主要由调节花青素生物合成基因 (ABGs) 表达的 MYB-bHLH-WD40 (MBW) 复合物控制。参与花青素生物合成的 MYB 调节剂在植物进化早期出现，因此可能在不同的谱系中发挥不同的作用。尽管人们已对双子叶植物中促进花青素的 R2R3-MYB 调节剂进行了全面探索，但在不同植物谱系的 MYB 调节剂之间的功能差异与保护之间几乎没有达成共识。在这里，我们整合了转录组分析、基因表达谱、功能获得实验和瞬时原生质体转染试验，在功能上表征单子叶植物香雪兰与 ABG 的相关性。当 FhPAP1 分别在香雪兰、拟南芥和烟草中过表达时，可以激活 ABG 以及 TT8 相关基因FhTT8L、AtTT8和NtAN1 。FhPAP1 可以与 FhTT8L 和 FhTTG1 相互作用形成保守的 MBW 复合物，并与其来自拟南芥的直系同源物共享相似的靶基因。FhPAP1 显示出比拟南芥和烟草中的同源物更高的反式激活能力。此外，我们发现FhPAP1种产生密集的花色素沉着。这些结果表明，虽然 MBW 复合物在测试的单子叶植物和双子叶植物之间具有高度进化保守性，但参与的 MYB 调节因子根据其激活域显示出反式激活能力的功能差异。
02
技术路线
03
主要结果
3.1 FhPAP1基因的分离和序列分析
通过对F. hybrida完整转录组数据的 BLAST 分析，发现一个序列编码与拟南芥 AtPAP1 同源性很高的 R2R3-MYB 转录因子，随后命名为FhPAP1（图 1A，GenBank 登录号MT210093）。FhPAP1的 702 bp 开放阅读框编码了一个由 233 个氨基酸组成的蛋白质，与拟南芥 AtPAP1 有 55% 的同源性性。氨基酸序列比对显示保守基序 [D/E]Lx 2 [R/K]x 3 Lx 6 Lx 3 R 存在于 FhPAP1 的 R3 结构域中，这被认为是在与 R/B 相互作用中起重要作用类 bHLH 调节剂。参与双子叶植物中花青素积累的 134 个 MYB 调节因子的比对在 R3 重复序列中显示出高度保守的精氨酸 (R)、缬氨酸 (V) 和丙氨酸 (A) 残基。本研究表明，单子叶植物香雪兰中的特征并不总是保守的。因为残基 V 被 D 取代，ANDV 中的 V 被 FhPAP1 中的 I 取代。
为了更好地定义 FhPAP1，构建了一个包含已知黄酮类 MYB 调节剂的系统发育树（图 1B）。在系统发育中产生了许多进化枝，这些进化枝暗示了它们的不同功能。FhPAP1 属于花青素进化枝，与 LhMYB6处于同一分支，它以前被确定为百合杂种中的花青素调节剂。这些结果表明FhPAP1可能编码F. hybrida中推定的 R2R3-MYB 花青素调节剂。
3.2 FhPAP1的表达主要与F. hybrida花色苷生物合成中的 LBGs 相关
在香雪兰中，花青素主要在花瓣中合成，并在花发育过程中逐渐积累。为了评估FhPAP1的表达模式是否在时间和空间上与F. hybrida中的花青素积累相伴，在五个发育阶段八个组织中检查了FhPAP1的转录本。FhPAP1的表达水平在花中从绿芽期到盛开期增加了近 30 倍（图 2A）。此外，FhPAP1在花青素过度积累的花瓣中高度表达，而在其他组织中表达水平较低（图2B）。这些结果强烈暗示FhPAP1可能在调节花青素生物合成中起作用。
为了评估FhPAP1和合适的结构基因之间假定的转录关联，鉴定了 14 个候选基因，并通过qRT-PCR确定了它们的时间表达谱。热图可视化了负责类黄酮生物合成的基因表达模式（图 2C）。结果表明，FhPAP1主要与LBGs聚集，在花发育过程中表现出逐渐增加的表达模式。其他三个花青素相关基因FhGL3L、FhTT8L和FhTTG1的表达也在花发育过程中也被检测到。结果表明，FhTT8L和FhTTG1与FhPAP1具有相似的表达模式，这表明它们可能在香雪兰花青素生物合成过程中协同作用。
3.3 FhPAP1 促进F. hybrida和其他植物中的花青素生物合成
为了解释FhPAP1在花青素生物合成中的调控功能，首先用过表达FhPAP1的载体瞬时转染从 Red River 愈伤组织中分离的小苍兰原生质体。正如预期的那样， FhPAP1显着增加了花青素途径中的LBG ，这证实了它们在花发育过程中的同时表达（图 3A）。有趣的是，EBGs 和FhTT8L也被激活，呈现出多倍的增加（图 3A）。为了进一步证实 FhPAP1 可以促进花青素积累，采用了另一种具有白色花朵的小苍兰栽培品种 Ambiance。如图所示图3B，所有结构基因的转录本，尤其是LBGs，以及FhPAP1和FhTT8L，在Ambiance花中都处于相当低的水平（图3B）。将含有FhPAP1的农杆菌菌株注射到 Ambiance 芽中会导致花瓣颜色变深并增加花青素含量（图 3C、D）。这些结果表明 FhPAP1 促进F. hybrida中的花青素生物合成。
为了进一步验证 FhPAP1 在调节花青素生物合成中的功能，选择拟南芥和烟草进行遗传转化试验。拟南芥中FhPAP1的过表达导致色素在不同组织和器官中的积累增加。代谢物分析表明，来自FhPAP1表达系的 4 周龄莲座叶比对照植物积累了更多的花青素和 PAs。与转基因植物中花青素的积累一致，内源EBGs和LBGs都被显着激活。此外，在转基因烟草植物的不同组织中观察到多种花青素和 PAs 的超累计，与野生型植物相比，几乎所有的 ABGs 都被激活。除结构基因外，还测定了转基因植物中 MBW 成分基因的表达。发现AtTT8基因表达增加约 200 倍，同时其他调节基因略有增加。此外，当NtAN1被激活时，内源性结构基因的上调最为明显总之，FhPAP1 在小苍兰和其他植物中在调节花青素生物合成方面是功能保守的。
3.4 FhPAP1 与 FhTT8L 和 FhTTG1 相互作用以控制F. hybrida中的花青素生物合成
为了更深入地了解小苍兰中潜在的 MBW 复合物，使用基于 Gal4 的瞬时转染系统在野生型拟南芥原生质体中直接评估 FhPAP1、FhTT8L 和 FhTTG1 蛋白之间的分子相互作用。FhPAP1、FhTT8L 和 FhTTG1 的反式激活能力首先通过与酵母 GD（Gal4 DNA 结合域）标签融合然后与Gal4共转染来检测：GUS（Gal4 DNA 结合位点促进 GUS 报告质粒）进入拟南芥原生质体. 融合蛋白将通过 GD 结构域与 Gal4 DNA 结合位点结合，然后当融合因子为激活剂时驱动GUS表达。值得注意的是，与 FhTT8L 和 FhTTG1 相比，GD 标记的 FhPAP1 能够显着促进 GUS 活性，表明 FhPAP1 是一种激活剂（图 4A）。随后，用HA标签替代GD-FhPAP1中的GD标签构建HA-FhPAP1，其不能促进Gal4：GUS表达缺乏与 Gal4 位点的结合域。当 GD 标记的 FhTT8L 或 FhTTG1 与 FhPAP1 相互作用时，反式激活因子 FhPAP1 将再次被募集到 Gal4 DNA 结合位点，然后导致GUS表达，表明 FhPAP1 可以与 FhTT8L 和 FhTTG1 蛋白相互作用（图 4B）。结果表明 FhTT8L 对 FhTTG1 或 FhTT8L 具有很强的亲和力（图 4C，D）。此外，这些蛋白质之间的所有相互作用都通过生物分子荧光互补 (BiFC) 测定重新验证（图 4E）。综合考虑这些相互作用，FhPAP1-FhTT8L-FhTTG1 复合物似乎确实在小苍兰花青素生物合成中起作用。
04
结论
总之，FhPAP1 和 AtPAP1 可能能够激活 ABG 和 bHLH 辅助因子。表达的 bHLH 因子与 WD40 蛋白一起可以显着增强 FhPAP1 对 ABGs 的激活作用。因此，提出了FhPAP1参与F. hybrida花色素沉着的转录调控模型（图9）。随着 Red River 中的花发育，FhPAP1 和 FhTTG1 可能会被初始化，并且 MYB 调节器会激活 ABGs 和FhTT8L的转录本。FhTT8L 进一步与 FhPAP1 和 FhTTG1 共同作用形成 MBW 复合物，可增强FhTT8L的表达。增加的 MBW 复合物也可以显着激活 ABG 的转录本。该系列最终导致花青素积累。然而，由于FhPAP1和FhTT8L在 Ambiance中的低表达，ABG 可能无法达到导致花青素生物合成的阈值。
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https://academic.oup.com/pcp/article/61/7/1365/5835879?login=true
END
06
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赛思基因科技（青岛）有限公司致力于开发转基因和基因编辑中的“硬核科技”，突破遗传转化中的基因型限制，辅助基因编辑育种。目前公司拥有国内数量最多的稳定遗传转化体系，包括但不限于花生、藜麦、大白菜、小白菜、辣椒、菜心、油菜、紫菜薹、樱桃萝卜、胡萝卜、甘蓝、抱子甘蓝、宝塔菜、紫/黄/绿花椰菜、青花菜、西瓜、南瓜、甜瓜、茄子、梨树、枣树、大豆、棉花等遗传转化体系。
公司可为广大科研和育种工作者提供稳定的，非嵌合的，多品种的过表达、基因沉默株系和基因编辑突变体。期待与您的深入合作，共同推动中国种业的进步。
https://academic.oup.com/pcp/article/61/7/1365/5835879?login=true
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